流式細(xì)胞儀是對細(xì)胞進(jìn)行自動分析和分選的裝置。它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細(xì)胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，并可以根據(jù)預(yù)選的參量范圍把指定的細(xì)胞亞群從中分選出來，流式細(xì)胞儀功能強(qiáng)大，下面由工業(yè)設(shè)計(jì)公司來談?wù)劻魇郊?xì)胞儀的發(fā)展趨勢：

 

一、 應(yīng)用對象從細(xì)胞到顆粒 

 

一般而言，流式細(xì)胞儀檢測的對象是細(xì)胞，而且是呈獨(dú)立狀態(tài)的懸浮于液體中的細(xì)胞，即單細(xì)胞懸液。組織和器官中的細(xì)胞，必須用各種方法制備成單細(xì)胞懸液，才能進(jìn)行檢測。細(xì)菌、浮游生物等也可以用流式細(xì)胞儀分析。一些不是細(xì)胞的單個(gè)粒子，如病毒、細(xì)胞核、染色體、原生質(zhì)體等也是流式細(xì)胞儀的檢測對象。實(shí)際上，用“顆粒”而不僅僅是“細(xì)胞”來定義流式細(xì)胞儀的檢測對象，顯然更有代表意義。因?yàn)榱魇郊?xì)胞儀可以將“顆粒”視同為“細(xì)胞”來進(jìn)行檢測，在特制的微球上包被抗原，抗體或核酸探針，以微球?yàn)檩d體來檢測各種可溶性蛋白、細(xì)胞因子、自身抗體、特定的核酸序列等，從而使流式細(xì)胞儀的檢測對象擴(kuò)展到分子范圍。

 

 

 

 

二、常規(guī)流式細(xì)胞儀檢測顆粒的范圍為0.5-50μm。 

 

電荷分選流式細(xì)胞儀檢測顆粒范圍與噴嘴直徑等相關(guān)，最大應(yīng)到噴嘴直徑的1/3-1/2，目前最大直徑的噴嘴為200μm。通過光路優(yōu)化，采用多角度光散射，使用特殊熒光探針，甚至加裝紫色激光收集散射光信號，有些流式細(xì)胞儀可以實(shí)現(xiàn)0.2μm顆粒與噪音信號的鑒別。

 

 

 

三、流路技術(shù)商品化 

 

絕大多數(shù)流式細(xì)胞儀基于鞘液流體動力學(xué)模式。因?yàn)樨?fù)壓進(jìn)樣省去了龐大的壓縮氣源，可以靈活使用各種上樣管，已經(jīng)成為幾乎所有公司新儀器的選擇。一般認(rèn)為，流式細(xì)胞儀采用毛細(xì)管而非鞘液，容易被大的細(xì)胞或聚集細(xì)胞所阻塞，而且流動細(xì)胞難以準(zhǔn)確聚焦，流速難以維持恒定。

 

 

 

四、從相對計(jì)數(shù)到直接絕對計(jì)數(shù) 

 

為滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，流式細(xì)胞儀必須采集一定數(shù)量的細(xì)胞，儀器設(shè)定以細(xì)胞數(shù)為停止條件。傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀測試結(jié)果為相對計(jì)數(shù)，即目標(biāo)細(xì)胞在某一總體系中的比值。隨著應(yīng)用深入，人們發(fā)現(xiàn)比值的變或者不變，以及變化大小不能反映細(xì)胞的真實(shí)變化，絕對計(jì)數(shù)，即單位體積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)被證明更具實(shí)際價(jià)值。最早是采用雙平臺法來解決以上問題，即用血細(xì)胞分析儀來獲得白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等濃度，再結(jié)合流式細(xì)胞儀測定的百分比來計(jì)算被測細(xì)胞的絕對計(jì)數(shù)值。由于該法需要使用兩種儀器，操作步驟多、變異系數(shù)大，不同實(shí)驗(yàn)室之間的差異也較大，因此應(yīng)用受到限制。后來人們采用微球法，即用已知濃度的微球作為參比，通過被測細(xì)胞和微球的比例關(guān)系來進(jìn)行絕對計(jì)數(shù)，但因計(jì)數(shù)微球價(jià)格較為昂貴，實(shí)際應(yīng)用受到限制。近年來，廠家的共識回到了測定進(jìn)樣體積這一思路上來，替代微球法直接進(jìn)行絕對計(jì)數(shù)，取得更為精確的結(jié)果。區(qū)別在于不同產(chǎn)品具體測定技術(shù)的差別。

 

 

 

五、光路優(yōu)化和光學(xué)新元件的應(yīng)用

 

龐大的水冷或氣冷的激光器逐漸被小型化的固態(tài)激光器取代。光纖傳導(dǎo)應(yīng)用越來越普遍。光纖耦合讓光能量傳輸更高效，而不為公司所專有。

 

 

 

六、以多色分析為核心的新型光學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展

 

早期流式細(xì)胞儀的主要應(yīng)用還是細(xì)胞DNA含量測定，這一技術(shù)對設(shè)備要求不高，通常配備一個(gè)散射光和一個(gè)熒光信號的流式細(xì)胞儀就足以應(yīng)付。隨著新型熒光探針的不斷開發(fā)和儀器軟、硬件的逐步更新，流式細(xì)胞儀多色熒光分析得到了迅速發(fā)展。必須注意的是，多色分析提供了多種細(xì)胞特性的相互關(guān)系圖，從而更加精確地界定一種細(xì)胞亞群，更好地對不同細(xì)胞進(jìn)行分類。但是，同時(shí)檢測的熒光染料越多，需準(zhǔn)確調(diào)節(jié)各通道之間的補(bǔ)償，技術(shù)難度更大，因?yàn)槠渲邪男畔⒘糠浅４螅e(cuò)誤信號摻雜的概率也相應(yīng)增加，所以數(shù)據(jù)分析時(shí)需格外注意，一般需采用不同的標(biāo)記方案多次相互驗(yàn)證才能得出重要結(jié)論。光譜流式和質(zhì)譜流式的出現(xiàn)克服了補(bǔ)償問題。

 

 

 

 

七、數(shù)據(jù)處理能力不斷提升

 

隨著數(shù)字化技術(shù)的引入，以及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的升級，流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)處理能力得到極大提升。數(shù)據(jù)處理速度：反映數(shù)據(jù)掃描頻率，用Hz表示。處理精度：信號采集精度，用比特表示，反映采集通道多少。目前儀器一般在20比特（2的20次方，100萬通道）以上，最高達(dá)32比特（43億通道）。單文件存儲能力：反映文件儲存能力，對稀有細(xì)胞分析有利。數(shù)據(jù)能力的提升直接影響到儀器的分析和分選速度。速度的提升是光路，流路和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)三者共同優(yōu)化改善的結(jié)果。

 

 

 

 

 

八、儀器不斷小型化到微流控

 

追求小型化，幾乎是所有流式制造商開發(fā)新產(chǎn)品的共識。“小”意味著節(jié)省空間，容易安裝和轉(zhuǎn)移，“小”更值得期許的是減少樣本體積，降低試劑消耗，提高檢測速度，以及縮小空間所帶來的光電及液路的改善。

微流控技術(shù)興起于上世紀(jì)90年代，顧名思義就是使用微通道（尺寸為數(shù)十到數(shù)百微米）處理或操縱微小流體。

 

九、融合顯微成像技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)

 

細(xì)胞生物學(xué)兩大技術(shù)平臺分別基于顯微鏡和流式，前者以形態(tài)分析為優(yōu)，可提供詳細(xì)的細(xì)胞圖像信息，但解釋主觀、費(fèi)時(shí)費(fèi)力；后者以統(tǒng)計(jì)學(xué)見長，卻缺乏成像能力，因此無法了解亞細(xì)胞定位。對于微弱熒光信號可以通過明視野細(xì)胞圖像輔助設(shè)定遮罩，特定加強(qiáng)遮罩下細(xì)胞熒光信號，實(shí)現(xiàn)對微弱熒光圖像的捕捉和分析。系統(tǒng)可以對每個(gè)細(xì)胞分析超過500種量化參數(shù)，包括細(xì)胞整體的散射光和熒光信號強(qiáng)度，以及對細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞信號分布的分析。圖像流式細(xì)胞儀無須為了得到細(xì)胞群統(tǒng)計(jì)學(xué)資料而損失豐富的形態(tài)信息，也無須為了獲得細(xì)胞細(xì)節(jié)而損失統(tǒng)計(jì)學(xué)功能。

 

十、專業(yè)化和臨床型儀器紛紛面世

 

臨床市場是商品流式細(xì)胞儀最具潛力的發(fā)展方向。但是，診斷流式試劑的研發(fā)和報(bào)證，以及符合檢驗(yàn)流程的儀器開發(fā)，與不斷增長的臨床應(yīng)用需求并不匹配。一些公司推出了專門的小型流式細(xì)胞儀，用于CD4細(xì)胞的快速計(jì)數(shù)，如FACSCount、CyFlow Counter等。邁瑞公司面向臨床用戶工作流程和場景推出BriCyte E6，針對淋巴細(xì)胞亞群分群等臨床常規(guī)分析，可以實(shí)現(xiàn)檢驗(yàn)儀器常有的一鍵得結(jié)果，免去繁復(fù)的電壓和補(bǔ)償調(diào)整，其LIS的雙向通信，數(shù)據(jù)管理都非常符合臨床診斷的期望。類似思路在后來上市的BD公司FACSlyric也有體現(xiàn)。老牌血球生產(chǎn)廠商Sysmex 在收購Partec后的第五年，推出了PS-10流式樣本前處理系統(tǒng)，配合新款流式XF-1600，實(shí)現(xiàn)樣本處理、離心和檢測的全自動化流程。詳情請見：全自動流式檢測時(shí)代的來臨！

 

可以期待，流式細(xì)胞儀未來將會作為一個(gè)重要的組成部分被整合到血液細(xì)胞分析流水線上，在這個(gè)系統(tǒng)中，血液細(xì)胞分析儀提供血常規(guī)結(jié)果和異常報(bào)警信息，流式細(xì)胞儀則根據(jù)這些信息對異常細(xì)胞進(jìn)行不同策略的精細(xì)鑒別。

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